箱内湿度对于培养工作来说是一项非常重要然而又经常被忽略的因素。因为饱和湿度环境可以避免培养液中二氧化碳逃逸，培养液中 pH值稳定，有利于细胞生长，足够的湿度水平并且要有足够快的湿度恢复速度 (如在开关门后)才能保证不会由于过度干燥而导致培养失败。所以二氧化碳培养箱使用过程中，在箱内托盘中放一定量的灭菌水(3／2至全盘)，使箱内成为饱和湿度环境。如使用者忘记补加水，使培养细胞处于低湿度甚至干热环境中，培养液二氧化碳气体易挥发，液体 pH值升高，影响细胞生长，在工作中要力求避免此问题发生。样本多时，箱内分区存放，培养物用筐或瓷盘存放，这样存取快速，缩短开门时间，减少箱内气体和湿度变化，节省气体，稳定了细胞生长环境。