采用Mini-Beadbeater组织研磨器破碎的方法进行了提取霞水母刺丝囊细胞毒素的研究。首先制备霞水母刺丝囊细胞, 然后研究破碎频率、破碎时间对提取霞水母刺丝囊细胞毒素浓度的影响。结果表明, 组织研磨器能够在2—3min内破碎约90%的霞水母刺丝囊细胞, 从而提高水母毒素的提取效率。SDS-PAGE结果显示, 提取的水母毒素蛋白条带没有发生明显差异, 是一种有效提取霞水母毒素的方法。
水母是一种胶质状的浮游动物, 其种类繁多, 主要包括四大类群:刺胞动物门的水螅水母类、管水母类、钵水母类以及栉水母门的栉水母类 (张芳等, 2005;张姝等, 2009) 。霞水母 (Cyanea sp.) 属刺胞动物门、钵水母纲、旗口水母目、霞水母科, 触须长2—4m, 广泛分布于我国沿海。近年来, 当夏季来临时, 大量的水母会聚集在近海区域集中出现, 给渔业生产、生态环境以及游泳者造成严重的影响 (仲霞铭等, 2004;Jiang et al, 2008;Xian et al, 2005) 。水母毒素是一类结构新颖的海洋生物蛋白, 具有多种生物活性, 如溶血活性、抗氧化活性、心脏血管毒性、肝脏毒性、酶活性和神经毒性等 (李翠萍等, 2008;Li et al, 2005;Kim et al, 2006;Radwan et al, 2000;Sanchez-Rodrıguez et al, 2006;Yu et al, 2007) , 这为开发新型的海洋药物提供重要的先导化合物发现途径, 而如何有效地从水母中提取毒素是研究毒素的结构、理化性质、生物活性以及对水母毒素进行开发应用的前提。
水母毒素主要存在于触手的刺丝囊细胞中, 因此提取水母毒素的途径主要有两种。其一, 直接对水母触手进行破碎提取毒素 (Li et al, 2005) , 该方法提取的毒素蛋白不可避免地含有大量的非毒素类蛋白其二, 先制备水母刺丝囊细胞, 然后再从刺丝囊细胞中提取水母毒素 (Brinkman et al, 2007, 2008;Helmholz et al, 2007, 2008) , 该方法在制备刺丝囊细胞过程中能够将大多数水母触手残余除去, 有效降低非毒素类蛋白的引入, 从而得到更纯的水母毒素。不同的破碎细胞方法对毒素提取效果也有较大影响, 目前破碎水母刺丝囊细胞的方法主要有超声波破碎法 (Radwan et al, 2001;Chung et al, 2001) 和研钵研磨破碎法, 超声波破碎的过程中会产生大量的热量, 常常会引起部分水母毒素在破碎提取过程中结构遭到破坏和活性丧失, 而研钵研磨法所需要耗费的破碎时间很长, 且提取率并不高。组织研磨器具有提取效率高、对蛋白作用柔和等优点 (Carrette et al, 2004) 。到目前为止, 利用组织研磨器从霞水母刺丝囊细胞中提取毒素的研究还未见报道。本文研究了利用MiniBeadbeater组织研磨器从霞水母刺丝囊细胞中提取毒素的条件和效果, 为霞水母毒素的深入研究和开发利用奠定基础。
霞水母 (Cyanea sp.) 于2008年8—9月采集于青岛第六海水浴场附近, 采集后迅速运回实验室, 人工将带有刺丝囊细胞的触手沿口腕部剪切下, 立即冷冻于-20℃冰箱中保存备用。
组织研磨器 (Mini-Beadbeater-1, Biospec, 美国) , 凝胶成像系统 (Power Look 1120, Firewire, 美国) , 荧光倒置显微镜系统 (Olympus IX70, Olympus, 日本) , 高速冷冻离心机 (GL220B2Ⅱ, 上海安亭科学仪器厂) 等。
考马斯亮蓝试剂, 牛血清蛋白 (BSA) , 分子量标准蛋白, 0.5mm玻璃珠等, 实验试剂均为分析纯。
霞水母刺丝囊细胞的制备方法参考Bloom等 (1998) 方法, 即把冰冻的霞水母触手浸泡在纯净的海水中, 4℃下自溶3—4d, 期间不断更换新鲜海水并搅拌以加速刺丝囊细胞从触手上脱落, 浸泡结束后, 缓慢倒掉上清浸泡液, 收集下层带有沉淀的浸泡液, 然后分别用纱布和孔径为0.250mm的分样筛过滤, 得到含大量刺丝囊细胞的提取液, 4℃, 1000g冷冻离心15min, 收集下层沉淀, 再用海水洗2—3次, 相同条件下离心, 即得到较为纯净的水母刺丝囊细胞, 冷冻干燥, 干燥后的霞水母刺丝囊细胞保存在-20℃冰箱中备用。
称取10mg刺丝囊细胞样品和移取1.2ml pH 7.6的磷酸缓冲液, 加入到6组破碎管, 分别用MiniBeadbeater在功率4200、4600、4800r/min下破碎30s、60s、90s、120s、150s、180s, 每破碎30s, 将破碎管取出置于冰水中冷却1min, 破碎完毕后于4℃、1000g冷冻离心5min, 收集上层液, 作为霞水母刺丝囊毒素, 以牛血清白蛋白 (BSA) 作标准, 用Bradford法 (Bradford, 1976) 测定毒素的浓度。
不同破碎条件下提取得到的霞水母毒素, 其SDS-PAGE根据Laemmli (1970) 方法, 分别采用5%的浓缩胶和12%的分离胶, 标准蛋白为b-半乳糖苷酶、牛血清白蛋白、卵白蛋白、乳酸脱氢酶、REase Bsp981蛋白、b-乳球蛋白、溶菌酶, 分子量分别为116.0、66.2、45.0、35.0、25.0、18.4、14.4kDa, 电泳后蛋白条带经考马斯亮蓝R-250染色, 脱色液脱色后于凝胶成像系统拍摄。
利用荧光倒置显微镜系统在放大倍数为200倍下观察组织研磨器在功率为4600r/min下不同破碎时间的细胞破碎情况。具体方法为:当细胞破碎完毕后取出破碎管并摇匀, 然后用移液枪吸取5l破碎液滴加到载薄片上, 缓慢加盖薄片并压匀, 于显微镜下观察并且记录破碎时间分别为0s、60s、120s、180s时的破碎效果图。
