氯羟吡啶又名克球酚，是一种广谱抗球虫增效剂，氯羟吡啶在环境中降解缓慢，可诱发人的心脏冠状动脉扩张和血流量增加，对于存在冠状动脉疾患的人群是非常危险的。氯羟吡啶具有一定的致畸性和胚胎毒作用[2]。我国政府规定了氯羟吡啶在鸡肉中的残留限量为5 000 μg/kg，在牛奶中的残留限量为20 μg/kg。

  关于氯羟吡啶残留的检测方法主要有气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC），气相色谱-质谱联用法（GC-MS)，液相色谱-质谱联用法（LC /MS），液相色谱-串联质谱法（LC-MS /MS）及国家标准GB29700-2013等，而有关牛奶中氯羟吡啶残留检测较少。本研究建立了一种简单、灵敏、可靠地检测牛奶中氯羟吡啶残留量的高效液相色谱定量分析方法。

实验

材料与试剂

  氯羟吡啶标准品（含氯羟吡啶（C7H7C12NO）99.7%），甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），磷酸二氢钾（分析纯），磷酸氢二钠（分析纯），碱性氧化铝柱。磷酸盐缓冲溶液（pH=7.0）：准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO4）2.09 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）1.40 g，加水溶解并稀释至500 mL，调节pH值为7.0。氯羟吡啶标准液：准确称取氯羟吡啶约25 mg，置250 mL容量瓶中加甲醇溶解，并稀释至刻度，配成质量浓度为100 μg/mL 的氯羟吡啶标准储备液，置4 ℃冰箱中保存，临用前，准确量取适量标准储备液，用体积分数为50%甲醇稀释成浓度为适宜浓度的标准工作液。

仪器与设备

  戴安高效液相色谱仪（配紫外检测器），漩涡混合器，离心机，分析天平（感量0.0001 g），氮吹仪。

实验条件

  色谱柱为反相C18 柱250 mm× 4.6 mm，粒径5 μm；流动相为磷酸盐缓冲液（pH=7.0）：乙腈（85：15）；流速为1.0 mL/min；检测波长为270 nm；进样量20 μL；理论塔板数按氯羟吡啶峰计算，应不低于1 500（实验数据理论塔板数在18 000 左右）；色谱测定取适量试样溶液和相应浓度的标准工作液做单点校准，以色谱峰面积积分值定量。

方法

提取

  准确称取5 g±0.05 g 试样，置于50 mL离心管中，加入1.0 g 左右氯化钠，2.5 g 左右硫酸镁，用25 mL乙腈分3 次各漩涡2 min，8000 r/min 离心5 min，分离并合并上清液备用。

净化

  将碱性氧化铝柱分别用10 mL甲醇、乙腈依次润洗，加入提取的上清液，过柱，收集流出液用氮吹仪吹干，浓缩液用1 mL 50%甲醇溶解漩涡1 min，用0.22 μm微孔有机滤膜过滤两次上机测定。

方法验证

标准工作曲线的制作及检出限

  在上述检测条件下，以50% 甲醇溶液为空白对照，利用氯羟吡啶标准溶液（质量浓度为100 μg/mL）配制系列稀释氯羟吡啶标准溶液（质量分数为0，5.0，10.0，20.0，100.0，200.0，300.0 μg/kg），测定其对应的

吸光度，以进样浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归计算，得到氯羟吡啶的线性方程和相关系数，并对空白样品进行20次的重复测定。

方法回收率及精密度实验

  采用对阴性样品进行加标回收试验来考察方法的准确度和精密度，即对本底不含氯羟吡啶的阴性牛奶样品，分别添加质量分数相当于20，30，100，200，300 μg/kg 水平的氯羟吡啶标准溶液，计算样品加标回收率，同时对质量分数为100，200，300 μg/kg加标样品进行平行样测定计算其精密度。

结果与分析

提取条件的选择

  直接使用乙腈对牛奶中氯羟吡啶残留的提取试验，结果表明，第一次离心后沉淀物变为胶状物质，第二次提取时无法混匀，回收率低；采用在样品中增加一定量的氯化钠和硫酸镁可以避免此现象发生，溶剂，回收率都比较理想。因此，研究加入乙腈后再加入一定量的氯化钠和硫酸镁作为提取溶剂来提取牛奶中氯羟吡啶。

净化条件的选择

  对同一个加标浓度提取的上清液，其中一个过使用碱性氧化铝柱净化后氮吹定容上机测定，另外一个不使用氧化铝柱净化直接氮吹定容上机，回收率分别为87.78%、91.71%，回收率结果无明显差异，但是后者定容后杂质较多，影响色谱柱的使用寿命，所以建议使用碱性氧化铝柱进行过滤净化。

结论

  本文研究了高效液相色谱法检测牛奶中氯羟吡啶的方法，通过对提取条件和净化条件的优化，建立了合理、可靠的测定牛奶中氯羟吡啶的高效液相分析方法。在确定的条件下，氯羟吡啶响应较好，定性检出限为5 μg/kg，定量检出限为15 μg/kg。对牛奶进行添加回收实验，平均回收率为87.34%到93.52%之间，重复实验的相对标准偏差为3.67%～6.71%。