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旋转蒸发器降解几丁质的贪噬菌及其应用的制作方法

2021-08-17 12:03:27
[导读]几丁质是一种天然无毒性且广泛存在的生物大分子,是地球上仅次于植物纤维的第二大生物资源。上海亚荣生化仪器厂指出
几丁质是一种天然无毒性且广泛存在的生物大分子,在虾蟹等甲壳类生物和昆虫的外壳及大多数真菌的细胞壁内都有发现。其结构类似纤维素,是由β-1,4-糖苷键连接起来的n-乙酰-d-葡萄糖胺直链高聚物,是地球上仅次于植物纤维的第二大生物资源。但由于几丁质化学性质十分稳定,溶解性较差,其应用受到限制。为了扩大几丁质的应用范围增加产品的附加值,需要对其进行进一步加工,近年来研究的热点为降解几丁质为几丁寡糖。目前降解几丁质制备几丁寡糖的方法主要有化学法、物理法和生物法。其中,可降解几丁质的微生物数量和种类有限,且尚未有报道说明贪噬菌可降解几丁质。如果能提供一株具有降解几丁质的贪噬菌,将具有重大的科研和应用价值。技术实现要素:本发明的目的是提供一株贪噬菌及其应用。该贪噬菌可降解几丁质,还具有植物促生作用,可防治植物病害,还具有一定的溶磷作用,可改善土壤质量。为实现上述发明目的,本发明所采用的技术方案是:一株贪噬菌,于2019年8月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心,保藏编号为:cgmccno.1.16908。相应的,一株贪噬菌,其16srna如seqidno1所示。相应的,一株贪噬菌,其菌落不透明,边缘规则,表面光滑,呈淡黄色状态,为革兰氏阴性菌,个体形态呈短杆状,无鞭毛、无芽孢生成。相应的,所述贪噬菌在降解纤维素中的应用,所述应用的ph为3~10,温度为10~37℃。相应的,所述贪噬菌在降解几丁质中的应用,所述应用的ph为3~10,温度为10~37℃。相应的,所述贪噬菌在改善土壤土质中的应用,所述应用的ph为3~10,温度为10~37℃。相应的,所述贪噬菌在抑制植物病虫害或病原菌中的应用,所述应用的ph为3~10,温度为10~37℃。优选的,所述植物病原菌包括番茄早疫病菌、禾谷镰刀菌、小麦丝核菌。优选的,所述病虫害包括水稻蠕虫。相应的,所述贪噬菌在提高植物免疫能力中的应用,所述应用的ph为3~10,温度为10~37℃。本发明具有以下有益效果:本发明提供了一种全新的贪噬菌,是未被发表过的一个新种。该贪噬菌具有优异的降解纤维素的能力和降解几丁质的能力。在农作物种植上,所述贪噬菌可提高植物的免疫能力,对农作物生长具有明显的促生作用。另外,研究还发现,所述贪噬菌对包括番茄早疫病菌在内的多种植物病原菌和植物病虫害具有明显抑制作用,可进一步提高农作物产量。同时,所述贪噬菌还可针对性将难溶性磷酸盐转化为可溶性磷酸盐,从而改善因化肥施用过多等原因而板结的土壤的土质情况。经过测试和检验,该贪噬菌在多方面均具有优异或良好的应用效果和应用潜力。附图说明图1为cy25r-8菌的菌落形态图;图2为cy25r-8菌的个体形态图;图3为cy25r-8菌的系统发育树示意图;图4为cy25r-8菌降解纤维素效果示意图;图5为n-乙酰d-氨基葡萄糖的标准曲线;图6为cm134l-2菌抑制番茄早疫病病原菌生长示意图。具体实施方式本发明使用的培养基如下:1、富集培养基:(1)溶液1:0.1%二水柠檬酸钠、0.6%k2hpo4、1.4%kh2po4、0.2%(nh4)2so4。需要说明的是,培养基中的“%”指溶质溶解于水中的w/v比,例如,“0.1%”具体指100ml水中含有0.1g对应物质,其余培养基中,无特别说明则与此相同。(2)溶液2:0.02%mgso4·7h2o。(3)溶液3:1.1%α-几丁质粉末溶液。(4)将上述三种溶液按体积比为89:1:10比例混合,即得所需的富集培养基。2、羧甲基纤维素培养基(cmc):1%羧甲基纤维素钠(cmc-na)、0.1%k2hpo4、0.05mg2so4、0.05%nacl、1%蛋白胨、0.025%(nh4)2so4。3、胰蛋白胨大豆肉汤培养基(tsb):1.7%胰蛋白胨,0.3%大豆蛋白胨,0.5%氯化钠,ph=7.0~7.2。4、胰蛋白胨大豆肉汤琼脂培养基(tsa):1.7%胰蛋白胨,0.3%大豆蛋白胨,0.5%氯化钠,1.8%琼脂,ph=7.0~7.2。去除tsa中的琼脂,即得对应的液体培养基tsb。5、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda):马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂18g,蒸馏水1000ml,自然ph值,115℃灭菌30min。6、无机磷培养基(pko培养基):葡萄糖10g,磷酸三钙5g,硫酸铵0.5g,氯化钠0.3g,氯化钾0.3g,七水合硫酸镁0.3g,硫酸锰0.03g,七水合硫酸亚铁0.03g,酵母膏0.5g,蒸馏水1000ml,ph=7.0~7.5。121℃灭菌,20min。7、几丁质固体培养基:所述几丁质固体培养基的制备方法为:将溶液a50ml、溶液b50ml、100倍的微量金属溶液10ml,100倍的维生素混合溶液10ml,酵母提取物1.0g,胶体几丁质10g,琼脂18g,加蒸馏水至1000ml,控制ph=7.0~7.2,混匀待其凝固即可。所述胶体几丁质的制备方法为:称取10g片状几丁质于三角瓶中,加入200ml浓盐酸,在磁力搅拌器上搅拌过夜,然后用4℃的水进行水合沉淀,4000r/min离心10min,随后用4℃纯水洗涤至ph为中性,即得。各溶液的具体组分如表1所示。表1几丁质固体培养基中各溶液成分表8、几丁酶诱导培养基:在所述富集培养基的基础上,增加1%的多聚蛋白胨、1%的酵母提取物。下面结合具体的实施例对本发明进行进一步的阐释。实施例一:菌株cy25r-8的分离和筛选1、样品采集及预处理。本发明所使用的菌株由中国科学院成都生物研究所从四川省成都市双流县中农业示范基地(102°54′~104°53′e,30°05′~31°26′n)中的川育25号小麦根中取样。将采取的小麦根样品放入保鲜袋中,立即送入实验室处理。到实验室后,将采集的样品用自来水冲洗干净,再用无菌水洗涤,自然阴干。将阴干后的植物组织剪成2~3㎜的小段,用体积分数为2~3%的次氯酸钠溶液浸泡5min,取出后用无菌水冲洗5次,将最后一次的洗涤水涂布在pda平板上,于37℃培养两天,若无菌生长,说明表面消毒彻底,可以开始对小麦根组织进行菌株富集与分离。2、菌株富集与纯化。将10g小麦的表面灭菌根组织与100ml富集培养基混匀,于28℃下培养7天。随后取富集培养的培养液300ul于3ml的灭菌后的tsb培养基里,按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6进行梯度连续稀释,然后取200μl最小稀释梯度的培养液,涂布于几丁质固体培养基上,做三个平行。将涂布好的各平板置于28℃培养2~3天,获得一株亮黄色菌落,命名为cy25r-8。然后再使用tsa(平板)进一步纯化2~3次该菌落,最后在含有20%(v/v)甘油作为保护剂的tsb中冻存于-80℃环境中。实施例二:菌株cy25r-8的鉴定1、分子水平鉴定利用细菌基因组快速提取试剂盒提取菌株cy25r-8的dna。选用细菌通用引物,对其16srrna基因进行扩增,引物序列如下:27f:5′-agagtttgatc(c/a)tggctcag-3′;1492r:5′-tacgg(c/t)taccttgttacgactt-3′。所述引物27f/1492r的合成、2×tappcrmastermix均购自生工生物(上海)有限责任公司。pcr扩增程序:95℃预变性5min;95℃变性30s,55℃复性30s,72℃延伸90s,29个循环;最后72℃延伸5min。pcr产物经1.0%琼脂糖电泳,核酸染料染色后荧光可见光凝胶成像分析系统检测。得到的16srrna基因片段,通过胶回收纯化,puc-tm载体连接,dh5α转化,阳性转化子经一代测序,获得其16srrna基因的序列,如seqidno1所示。将获得的序列在genbank中使用blast程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)与ezbiocloud数据库可利用的序列进行比较,确定其进化关系。运用neighbour-joining法在mega7.0中构建进化树,进化树的拓扑结构通过自举分析测试法基于1000次重复进行评估,结果如图3所示。经数据库序列对比,与cy25r-8亲缘关系最近的模式菌株为variovoraxparadoxusnbrc15149t,v.guangxiensisdsm27352t,v.gossypiijm-310t和v.boronicumulansbam-48t,其同源相似性为99.04~99.59%,同时,cy25r-8在系统进化树中单独成支。(2)采用全基因组鸟枪法(wholegenomeshotgun,wgs)策略,通过构建约350bp大小的文库,利用第二代测序技术(next-generationsequencing,ngs)-illuminahiseq测序平台的pe150测序方法对所述菌株进行基因组测序。对所获菌株的下机原始序列中低质量或污染序列进行修剪及过滤,使用软件hga2和quast进行序列组装。利用http://ggdc.dsmz.de提供的genome-to-genomedistancecalculator计算菌株cy25r-8与上述16srrna基因序列上亲缘关系最近菌株的dna-dna分子杂交(digitaldna-dnahybridization,dddh)值(包括置信区间c.i.),以及通过orthoani工具计算菌株之间的平均核苷酸同源性(averagenucleotideidentity,ani)值,结果如表2所示。表2菌株cy25r-8与模式菌株的基因组特征比较示意表菌株cy25r-8与参考菌株的dddh值在29%左右,ani值在84~86%,这些数值低于建议和普遍接受的物种界线,即dddh为70%,ani为95%~96%。因此可以证明菌株cy25r-8代表variovorax属的一个新种。所述菌株已于2019年8月19日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc),分类命名为:贪噬菌(variovoraxsp.)保藏编号为:cgmccno.1.16908,保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所,邮编:100101。2、菌株cy25r-8的生理生化特征鉴定(1)对该菌株进行一系列特征鉴定:参照《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版及《常见细菌鉴定手册》中实验方法进行鉴定;其中,碳源利用情况采用biolog全自动细菌鉴定系统,底物代谢采用api20ne试剂条鉴定,脂肪酸成分测定用gc-ms分析。具体结果如表3、4所示。表中“+”表示呈阳性,“-”表示呈阴性。表3api20ne和常规鉴定实验结果表生理生化特征检测结果革兰氏-氧化酶+过氧化氢酶+吲哚-凝胶-水解淀粉-硝酸盐还原+h2s产生-v-p-m.r+脲酶+蔗糖发酵+,产酸,不产气葡萄糖发酵+,产酸,不产气甘露糖发酵+,产酸,不产气d-麦芽糖发酵+,产酸,不产气表4碳源利用情况表(biolog实验结果)底物结果底物结果糊精+d-葡糖醛酸+d-麦芽糖-葡糖醛酰胺+d-海藻糖-粘酸+蔗糖-奎宁酸+d-苹果酸+丙酮酸甲酯+蜜三糖-l-乳酸+α-d-乳糖-柠檬酸+d-蜜二糖-α-酮-戊二酸+l-苹果酸+吐温40+d-半乳糖+1%乳酸钠+3-甲酰葡糖+乙酸-d-果糖+甲酸-d-甘露醇+d-阿拉伯糖+甘油+d-葡糖-6-磷酸+d-果糖-6-磷酸+醋竹桃霉素+d-天冬氨酸+利福霉素sv+l-丙氨酸+硫酸四葵纳-l-焦谷氨酸+万古霉素+l-天冬氨酸+四唑紫+l-谷氨酸+四唑蓝+d-半乳糖醛酸+亚碲酸钾-d-葡糖酸+氨曲南+l-半乳糖醛酸内酯-溴酸钠-3、通过培养和外观观察发现:在tsa培养基上25℃培养2d后,培养基上的菌落中间凸起,不透明,边缘规则,表面光滑,呈淡黄色状态。该菌株为革兰氏阴性菌,在显微镜下个体形态呈短杆状,无鞭毛,无芽孢生成。其菌落和个体形态分别如图1和图2所示。4、生长条件优选在不同温度、ph、盐度中分别进行培养,生长情况如表5所示。其中,“-”表示不生长;“+”表示生长;“++”表示生长良好;“+++”表示生长优。表5不同情况下菌株cy25r-8的生长情况从表5可知,cy25r-8菌株在10~37℃的温度范围内均可以生长,最适生长温度范围为25~37℃;在ph为3~10的范围内均可以生长,最适生长ph为6~8;菌株可生长的盐度为0~5%,最适为0~2%。cy25r-8菌株可在常见的tsa培养基中进行增殖培养。利用常规固体斜面培养、低温保藏的方法,每次传代可保藏3个月以上;以干燥冷冻法制作的长期保藏菌种,可保藏1年以上,以20%甘油管在-80℃条件下,可进行长期保藏。实施例三:cy25r-8菌株应用性能展示1、降解纤维素实验。使用cmc固体培养基扩繁cy25r-8菌株(30℃培养3天),随后用2mg/ml的刚果红溶液对cmc固体培养基进行染色,然后用蒸馏水和1m的nacl各清洗一次,照相。结果如图4所示,在cmc固体培养基上,cy25r-8菌株的周围产生了透明圈。证明cy25r-8菌株具有降解纤维素的能力,可广泛应用于纤维素降解领域。2、降解几丁质实验。(1)绘制n-乙酰d-氨基葡萄糖标准曲线。配制1mmol/ml的n-乙酰-d-氨基葡萄糖标准品,分别稀释成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6μmol/μl的不同浓度的n-乙酰-d-氨基葡萄糖溶液。准确移取1ml于37℃下反应60min,随后加入500uldns,煮沸显色5min。再用冷水冷却至室温。然后稀释5倍,用单蒸水作为空白对照在540nm下测定吸光值,绘制n-乙酰-d-氨基葡萄糖标准曲线。结果如图5所示。(2)将菌株在tsb培养基中培养24h,随后按体积比为1:100,将培养液转接至几丁酶诱导培养基中,促进菌株成长。培养24h后,在4℃、10000r/min下离心10min,取上清液。(3)取上清液200μl于1.5mlep管中,加入浓度为1%的几丁质200μl、柠檬酸缓冲液300μl。其中,所述几丁质为:使用胶体几丁质和粉末几丁质分别进行测试。加料结束并充分混匀后,在30℃下水浴反应1h。然后加入500μldns溶液,煮沸5min,随后快速冷却至室温,离心,取上清液,测od540。每组设三个重复,取平均值。根据n-乙酰-d-氨基葡萄糖标准曲线计算酶活。(4)酶活定义为:在30℃反应条件下,每小时分钟释放1μmol还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位(u/ml)。菌株对胶体几丁质的酶活为0.45u/ml,对几丁质粉末的酶活为0.40u/ml。本发明提供了一株具有几丁质降解作用的贪噬菌。3、抗生素敏感测试参照:mataja,martínez-canovasj,quesadae,bejarv.adetailedphenotypiccharacterisationofthetypestrainsofhalomonasspecies.systapplmicrobiol2002;25:360–375,进行抗生素敏感测试。具体为:将cy25r-8菌株涂布于tsa培养基平板上,同时用无菌的镊子夹取不同种类的抗生素滤纸片放于平板。置于28℃培养2天后进行观察,若滤纸片周围出现抑菌圈,则表明实验菌株对相应的抗生素敏感、不耐药;反之,若不出现抑菌圈,即为不敏感、耐药。结果如表6所示。其中,“+”表示有抑菌圈,“-”表示无抑菌圈,“+/-w”表示有抑菌圈,但是不明显。表6抗生素敏感试验结果抗生素结果抗生素结果抗生素结果头孢西丁+氯霉素+氨苄西林-丁胺卡那+四环素-呋喃妥因-萘啶酸+庆大霉素+新生霉素+妥布霉素+卡那霉素-磷霉素+/-w头孢噻污+链霉素-万古霉素-头孢挫林+头孢哌酮+红霉素+/-w多粘菌素+头孢他啶-林肯霉素-克林霉素-阿莫西林-利福平+环丙沙星+青霉素-氧氟沙星+4、溶磷作用(1)菌株的活化:取保存的cy25r-8菌种甘油管10μl涂布于tsa平板上,于28℃下培养2d进行活化。随后挑取单菌落接种于tsb液体培养基中,于28℃下培养2天。获得cy25r-8菌株的菌体悬浮液。(2)溶无机磷的测定及测量:在250ml三角瓶中分别加入50ml无机磷培养基。接种1mlcy25r-8菌株的菌体悬浮液,以灭活菌作为空白对照,在30℃、200r/min下分别振荡培养5d。取样品,将样品在10000r/min下离心10min,取上清液用钼蓝比色法测定有效磷含量,重复三次。结果显示:cy25r-8菌株对磷酸三钙的平均转化量达113.55±8.9mg/l,远高于普通贪噬菌。cy25r-8菌株对磷酸三钙的高转化能力证明其具有植物促生、土壤土质改善的巨大潜力。5、抑制植物病原真菌的作用采用对峙培养法测定菌株对番茄早疫病菌(alternariasolani)进行抑制试验。具体操作如下:(1)菌株的活化:取保存的cy25r-8菌种甘油管10μl涂布于tsa平板上,于28℃下培养2d,然后挑取单菌落接种于tsb液体培养基里,于28℃下培养2天,获得活化的cy25r-8菌株。同时用接种环挑取番茄早疫病菌的菌丝划线于pda培养基上,于37℃下培养5~7d,获得病原真菌菌落。(2)挑取步骤(1)中得到的病原真菌菌落,利用圆形打孔器取带有病原真菌的菌饼接种于pda培养基正中央,然后在距真菌1~2cm位置的四周各接种上cy25r-8菌株(图6中8号菌株),及大肠杆菌dh5α(图6中6号菌株)。37℃培养一周。(3)结果如图6所示。cy25r-8周围产生透明圈,并减少了番茄早疫病菌菌丝的成长;证明其对番茄早疫病菌有明显的拮抗作用。实施例四:cy25r-8菌株的代谢产物分析及作用分析1、将cy25r-8从甘油管中转出,活化与复壮。按1:100的比例接种到tsb培养基准备发酵种子液,再将种子液按1:10转接至含有1000ml的1/2r2b培养基(购自青岛海博)的2000ml三角瓶中,在180rpm、28℃环境下摇瓶发酵培养10d。将发酵液离心,取上清液,将得到的发酵液加入15%的amberlitetmxad16,180rpm、2h。随后用水、50%甲醇/水、甲醇依次洗脱,再真空旋转蒸发得到31.11g粗提物。将粗提物过c18反相柱色谱,用10%~100%体积比的甲醇/水依次洗脱、分离、提纯,得到18种化合物。2、分析、验证各化合物,具体方法包括:旋光由perkin-elmer341旋光仪测定;一维、二维核磁共振谱图用brukeravance600和ascend400核磁共振仪在20℃恒温测定,以tms为内标;低分辨质谱(ms)用watersxevotq质谱仪测定;高分辨质谱(hr-esi-ms)用brukermicrotofqii质谱仪质谱仪测定;薄层层析硅胶gf254和柱层析硅胶(100~200,200-300目)均购于青岛海洋化工厂;制备型hplc采用北京创新通恒科技有限公司的lc3000液相色谱仪,配有uv/vis检测器和ymc公司的c18高效液相色谱柱(20×250mm;10μm);半制备型hplc采用agilenttecnologies1260infinity和perkin-elmer200液相色谱仪,配有uv/vis检测器和phenomenex公司的c18高效液相色谱柱(10×250mm,5μm);分析型hplc采用agilenttecnologies1260infinity液相色谱仪,配备有uv/vis检测器和agilent公司c18高效液相色谱柱(4.6×1250mm,5μm);hplc的检测波长均采用208nm;液相色谱使用的水为超纯水,其它所用溶剂均为分析纯,在使用前均经过重蒸处理。

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